人工辅助生殖精子预处理策略

一、精子供应的最佳时间(精子提取)

国内外文献报道，禁欲时间过长和过短对精液质量有不同的影响。卫生部《人类精子库基本操作和技术规范》要求精子捐献志愿者禁欲3-7天，而世界卫生组织建议禁欲2-7天。

对于男性来说，所谓的“让士兵保持一千天并使用一段时间”，虽然不需要让精子保持一千天，但精子生产需要大约72天，成熟需要大约12天。如何“保留精子”并仔细计算，以达到最佳精子质量并在第一场战斗中成功受孕？长期以来，生殖工作者一直最为关注。然而，在人工辅助生殖技术中获得良好的精子对ART的成功率非常重要。 

一、禁欲时间对人类精液质量的影响

人工辅助生殖精子捐献者的禁欲时间是否与精子少、弱和异常的患者相同？

以色列不孕症研究小组Levitas做了以下工作

根据世界卫生组织的标准和分析方法，对6008份男性9489份精液样本进行了严格评估。结果分为两组:一组为正常，另一组为少精子症，也分为轻度(10-19.9×0/ml)，中度(4-10×10，重度1-4×10/ml)

结果表明:

正常人禁欲3~7天，生命力、体型和数量最佳。

>。10天后，精子质量大大降低。

少精组禁欲一天后精液质量最好。

>。4天后，精液质量明显下降。

作者认为:

1.少精子睾丸的精子生产速度相对较慢，向附睾的运输速度比正常人慢得多，几乎慢3-4倍。储存在附睾中供使用的精子已超过储存期，精子质量下降。

2.为什么精子减少和禁欲时间延长会导致质量下降？

主要原因是少精子症患者血液中氧自由基含量高于正常人。会破坏含有大量不饱和脂肪酸的精子致死，而死去的精子会释放更多的活性氧来破坏其他更多的精子，造成这样的恶性循环，使精子质量每况愈下。

3.更好的节欲日和节欲时间会影响成功的机会吗？

Jurema等人发现，禁欲时间越长，接受促排卵药物和人工授精治疗的夫妇的妊娠率越低。

禁欲3天，4-10天> 10天

妊娠率为14% 10% 3%

(2)省计划生育研究所的张新宗和姚报道了2006-2008年间6414例患者的精子质量与禁欲时间的关系。

结果表明:

禁欲3 ~ 7d后，精子质量和精子密度随着禁欲时间的延长而增加，向前移动精子的百分比随着禁欲时间的延长而降低。禁欲时间对精子形态参数和前向运动精子的冷冻保存和复苏率没有影响。冷精液禁欲3-5天的合格率明显高于禁欲6-7天，捐精者的最佳禁欲时间为3-5天。

对于精子体积大、精子密度高、前向运动精子百分比低的精子供体，建议适当缩短禁欲时间，反之亦然。

(3)禁欲时间对人类精液质量的影响(fertlister il 2004: 82: 57-65)

远景调查

研究禁欲时间对精液参数和精子DNA片段的影响。

研究机构:比利时的根克生殖技术研究所和美国的明尼苏达州生殖医学中心。

人群:16名同意参与不孕症调查的男性志愿者。

主要观察指标:禁欲1天、3天、5天和8天后的精液参数(世界卫生组织标准)、精子DNA片段和染色体质量。

结果:16名志愿者中只有11名男性被纳入分析，因为5名志愿者没有严格遵守禁欲时间要求。禁欲时间对精液体积和精液浓度有显著的负面影响，但对精液酸碱度、精子运动性、运动性、A级精子比例和形态无显著影响。不同禁欲时间的精子DNA片段没有明显变化。禁欲1天，未成熟精子与染色质的比例明显增加。

这是首次研究禁欲时间与精液参数、DNA片段和染色体质量之间的关系。精子数量和精子体积随着禁欲时间的增加而增加，但禁欲时间不影响精子的酸碱度、运动率、运动率、精子的甲级比例、正常形态和精子的DNA片段。短期禁欲(24小时)后精子染色体质量下降，禁欲5天后高密度精子百分比(高DNA染色染色质未成熟精子百分比)显著高于高密度精子百分比。

(但是，样本太小，没有男性不育精子的对照报告。)

二。精子质量和精子选择方法

如何选择健康正常的精子进行ICSI？

(ICSI中精子选择的新标准:精子头部双折射(Fertil Steril 200890:104-12)

意大利博洛尼亚生殖中心的Gianaroli等人进行了一项前瞻性随机对照研究，研究人类精子头部双折射在ICSI精子选择中的应用。

人群:实验组——根据精子头部的双折射选择精子进行ICSI的夫妇辅助妊娠，而对照组是通过常规ICSI辅助的夫妇。

方法:分别分析精液处理前后头部双折射精子比例与精液样本质量的关系。同时比较实验组和对照组的胚胎发育和临床结局。研究样本:实验组112例，对照组119例。实验组采用偏振光显微镜选择头部双折射精子进行ICSI辅助妊娠，对照组采用常规ICSI辅助妊娠。

主要观察指标:比较两组的受精率、卵裂率、妊娠率、着床率和持续妊娠率，并分析精液处理前后双折射精子在头部的比例与精液标本质量的关系。

结果:正常精液标本中双折射精子的比例明显高于弱异常精子标本(无前向运动精子)和睾丸精子抽吸精子。虽然实验组与对照组的受精率和卵裂率无显著差异，但对于男性因素严重的病例(无前向运动活动的少弱精子症和睾丸取精)，实验组的临床妊娠率、连续妊娠率和着床率均显著高于对照组。

实验组和对照组的实验室结果和临床结果

实验组

控制组

P

周期性

112

119

年龄(平均标准偏差)

34.8 4.4

35.2 4.5

受精卵数量(%)

235/317(74)

248/342(72)

胚胎(%)

204(87)

210(85)

第2-1天胚胎数(%)

178(87)

177(84)

第2-4天细胞的一级胚胎数(%)

66(32)

57(27)

第3天1级胚胎(%)

144/164(88)

117/135(87)

第3-8天细胞的一级胚胎数(%)

54(33)

27(20)

& lt0.025

移植周期数

101

104

移植胚胎数(平均标准偏差)

184(1.8±0.7)

196(1.9±0.7)

临床怀孕人数(%)

31(31)

22(21)

植物数量(%)

35/184(19.0)

22/196(11.2)

& lt0.05

堕胎数量(%)

5(16)

9(41)

0.035

持续妊娠的病例数(%)

26/112(23)

13/119(11)

& lt0.025

结论:精子头部双折射分析可作为一种诊断工具，也是一种新的精子选择方法。

(3)曲细精管生殖细胞的体外、体内培养和精子发生

(1)大鼠生精小管生殖细胞的体外培养和精子发生

张燕，内蒙古大学教育部哺乳动物生殖生物学与生物技术重点实验室；罗芬华；吴的报告:建立长期共培养体系和观察方法，为精子发生研究提供细胞模型。通过大鼠生精小管的生殖细胞和支持细胞的共培养，在显微镜下观察睾丸的精细胞。从8日龄大鼠中取出睾丸，取出生精小管组织，切成2mm大小，转移到培养皿中，在37度、5%co2恒温细胞培养箱中培养，培养液每2-3天更换一次。尼康德2000-U显微镜与计算机连接，自动摄影软件观察。大约两周后，观察到支持细胞和生殖细胞开始在组织附近存在。随着培养时间延长至3个月，生殖细胞相继爆发，在整个培养体系中观察了6个月从精母细胞到精细胞的过程。

结果:体外培养的睾丸支持细胞和生精细胞存活6个月以上。培养过程中，观察到精母细胞、圆精细胞和长精细胞。

结论在不添加任何细胞因子和生长因子的情况下，大鼠生精小管生殖细胞可长时间增殖和分化，并持续产生精细胞。这一结果表明，组织块和共生支持细胞可以为生殖细胞的增殖和分化提供必要的细胞因子。该方法为体外研究精子发生提供了实验依据。

(2)曲细精管生殖细胞的体内培养和精子发生

冷冻保存的未成熟睾丸组织移植

北京大学深圳医院中心实验室俞杰等报道，从冷冻睾丸组织中恢复精子发生的可能性有助于癌症患者的生殖能力和濒危物种延续的可能性。

将1-2日龄新生大鼠睾丸组织放入-80℃超低温冰箱中冷冻保存2周，然后将冷冻组织移植到雄性去势免疫缺陷小鼠背部皮下组织中4、5、8周。观察生精小管结构和生精细胞，并与新鲜睾丸组织进行比较。冷冻移植的睾丸组织与新鲜睾丸组织相同，未成熟的生殖细胞可在受体中继续生长发育。继续取出小鼠睾丸组织移植物2周，进行再次移植。在再次移植后的第四周，观察到一些包快速生长，并且在显微镜下观察到圆形精子细胞或甚至长精子细胞。

结论:无论是第一次移植还是移植到另一个受体，新生小鼠睾丸组织移植物都能继续存活和生长。它不需要特殊设备，简单易操作，适用范围广，适用于各种场合的生精细胞冷冻保存。

四.食物和药物对精子的影响

(1)葡萄酒对小鼠生长发育和睾丸功能的影响

南京农业大学动物研究所的张高震等人报道了长期饮酒对小鼠长期发育和繁殖的毒性影响。

将24只21日龄断奶幼鼠随机分为三组:啤酒组、白酒组和对照组。啤酒组自由饮用啤酒，白酒组饮用5%的稀释酒，对照组饮用自来水。实验后5周，称重体重、脏器重量等指标，检测附睾精子密度和精子畸形率，观察睾丸组织形态学。
 

结果在整个实验期间，啤酒组体重明显增加，器官重量受到不同程度的影响。白酒组精子密度明显下降，精子畸形率也明显增加。睾丸形态学经历了不同程度的病理变化。啤酒组睾丸间隙增宽，间质细胞增生。白酒组睾丸间质间隙进一步扩大，生精小管内生精细胞排列紊乱、松散，生精细胞间存在空间隙，有的甚至变性、坏死、脱落，有的生精小管生精细胞全部脱落或变性、消失，生精小管壁萎缩变薄。

结论:长期饮酒对小鼠生长发育和睾丸功能有毒性作用。

(2)吸烟导致精子畸形率增加

英国著名杂志《柳叶刀》介绍说，吸烟会导致畸形。你每天吸烟越多，异常精子的发生率就越高，你吸烟的历史就越长，你的异常精子就越多。同时，你的精子越来越少，越来越弱。每天抽21-30支烟会增加精子畸形率。吸烟引起精子损伤的机制可能是:香烟中的尼古丁引起精子染色体突变；吸烟会抑制精子的动态酶系统，降低精子活力。血浆中睾酮的浓度降低了睾酮的结合量，精子发生减少。

综上所述，人工辅助受精前应根据患者的具体情况对精子进行预处理:

1.如有可能，对男性不育患者进行3-5次精液检查或仔细分析他们之前的精液检查，找出禁欲时间与精液质量之间的关系，并预测精液提取前的禁欲天数。

2.除了掌握节欲的时机，等待人工辅助受精的患者应调整日常生活，戒烟，少喝酒，保证睡眠，补充维生素E、维生素C、锌片，提高精子质量，以免入不敷出。

3.为病人取精液创造一个安静温暖的环境。如有必要，在服用精液前口服单剂量的PDE-5抑制剂，并给予足够的刺激以获得高质量的精液样本。

4.当对无精子症患者或严重少精子症患者进行睾丸活检时，可以考虑体外睾丸组织培养或多精子冷冻保存，并且精子足以用于人工辅助受精。

5.通过首先治疗明显引起精子质量的致病因素，如精索静脉曲张和副性腺感染，可以提高精子质量，从而提高人工辅助受精的成功率。